光学显微镜原理

                                                                                      作者：陆工

w        光学原理

         将两个正透镜恰当地调节组合，放大标本，以供观察。接近标本的正透镜Lo称为物镜，可将标本放大1~100倍左右，形成倒立实象A’B’。接近观察者眼睛的正透镜Le称为目镜，可有5~20倍的视角放大。离观察者眼睛约250mm（称为明视距离）处，形成正立的虚象A”B”。观察着通过目镜可以看到该虚象A”B”。

 

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w        光学系统组成

n       照明系统

光源

集光镜（视场光栏）

聚光镜（孔径光栏）

n       成象系统

物镜

镜筒（管镜）

目镜（眼睛）

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

光学显微镜术语

w        放大倍率和总放大倍率

     M = Mo × Me (×Mi)

M：总放大倍率

Mo：物镜放大倍率

Me：目镜（或摄影、投影目镜）放大倍率

Mi：中间透镜放大倍率（一般为1）

w        物镜数值孔径

衡量物镜分辨率的专项指标

N.A = n  sinθ

 

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w        分辨率

   光学系统所能分辨的两个点之间的最小间隔距离，称为该光学系统的分辨率：

              ε= λ/ 2NA

                   λ ：光源波长

                   NA：数值孔径

w        视场光栏

■视场光栏是为限定标本面被照亮的范围（观察范围）而设的装置。它也能控制标本表面、透镜表面和部分镜筒内壁所产生的杂散光，减少晕光，有利于观察到高对比、高清晰的标本象。

■做显微摄影的显微镜，必须配备视场光栏。

■视场光栏大小的控制（见下页图示）

 

 

 

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w        孔径光栏

      孔径光栏起调节成象光束物方孔径角的作用，也即 调节分辨率（孔径光栏本身不能决定分辨率的大小，分辨率的大小由物镜决定）。并对对比度、景深都有影响。下表是孔径光栏与这三者之间的定性关系。

	分辨率	对比度	景深	亮度
孔径光栏全开	高	低	浅	亮
孔径光栏缩小	低	高	深	暗

 

          孔径光栏大小的调整

    通常，孔径光栏的大小以物镜的数值孔径可以用到70﹪~80﹪为好。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  w        聚光镜

   聚光镜的作用是聚集照明光能，明亮和均匀地照亮标本。它能调节象质，影响分辨率、对比度、景深和亮度。

 w        柯勒照明

   获得均匀照明效果的一种照明光学系统，也称为平行光照明。（见下页图示）

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

w        卤素灯

n       充有卤族元素的钨丝灯。

n       特点：亮度高， 色温也高、而且在整个使用寿命内几乎不变。

n       注意点：使用电压不能太低，更换灯泡时不能直接用手拿取灯泡，应戴布手套或用干净手绢、镜头纸包裹。如果新的灯泡沾有指纹等脏物，可用镜头纸蘸酒精擦拭。

w        物镜

n       光学仪器中向着目标物体，并对目标物体成实象的透镜或光学系统。显微物镜是将近处物体或物体细微部分成放大实象于目镜前焦平面上的物镜。

w        目镜

n       用来观察被物镜所成的象，并具有一定视角放大率的透镜或光学系统。

w        齐焦

n       不同倍率的物镜转换使用时几乎不需要调焦。

w        齐焦距离

n        45mm和60mm

w        景深

n       能在象面上获得清晰象（物点所成的象点弥散圆不能被接收器所分辨）所对应的物方空间深度。

w        机械筒长

n       安装物镜、目镜的机械零件的基准端面之间的空气距离。

w        物镜种类

n       消色差物镜(Ach)、平场消色差物镜(Plan)、复消色差物镜(Apo)、平场复消色差物镜Plan-Apo、油浸物镜(Oil)。

n       相衬物镜(Ph)、荧光物镜(Fluor)、偏光物镜(p)

 

w        物镜标识

 

倍率	1X	2X	4X	10X	20X	40X	60X	100X
色环	黑	茶	红	黄	绿	浅蓝	瓷蓝	白

 

      w        标识例

           Apo  40/0.95                Plan  10/0.25  Ph

           160 / 0.17                         ∞/0.17

 

w        目镜标识

            10×/18

             表示放大倍率10倍，视场18毫米。

w        聚光镜标识

Abbe    1.25

表示阿贝聚光镜，数值孔径1.25光学显微镜术语

 

光学显微术

几种光学显微观察方法：明场、暗场、相衬、荧光、偏光、微分干涉相衬

w        明场显微术

w        照明入射光线直接照亮并透过标本，进入物镜成象。

w        如果标本是一块透明玻璃，从目镜中只看到视场内呈现明亮一片。

w        标本上的组织是通过颜色、明暗而衬映在明亮的视场内，称为“明场”。

w        暗场显微术

w        直射的照明光线以很大的倾斜角照射标本，透过的光线无法进入到物镜内。

w        如果标本是一块透明玻璃，从目镜中只看到视场内呈现漆黑一片。

w        标本上的组织改变了照明光线的方向，使得只有这一部分改变了方向的光线才能进入物镜成象。

 

w        相衬显微术

n       原理

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

   n        根据傅立叶变换，象面光振动的复振幅表示为：

                         E’(x’,y’) = ±it + i∮(x,y)

                        位相物体的光强：

                         I(x’,y’) ≈ t 2 ± 2t∮(x,y)

                       即在象面上得到与物体的相位分布成线性关系的光强分布的象。其中，透过 直射零级的环带镀以金属膜，透过率，使振幅衰减。同时产生一个相位差。

   n       亮暗相衬：

                        相板镀金属膜，膜厚等于四分之一波长，位相物体的象比背景亮，为亮相  衬。膜厚等于四分之三波长，位相物体的象比背景暗，为暗相衬。

   n       霍夫曼相衬

   n       调制相衬（Modulation Contrast)

w        荧光显微术

n       荧光的特性

1. 要激发出一种物质的荧光，必须能先吸收进一种光。

2. 荧光波长长于吸收波长。

3. 每种物质都有它特定的荧光光谱。

4. 荧光光强远低于激发光光强（10-3~10 -5)。

5. 与激发光的方向无关。

6. 荧光强度与激发光强、标本密度、荧光效率 成正比。

n       其他特性

                衰退、 对称

n       荧光照明器

         原理图

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

n       二向色镜的光谱特性（如图）

 

n       荧光物镜的特点

n       紫外光透过率高

n       无荧光

n       高数值孔径

 

w        偏光显微术

n       利用偏振光及其干涉的原理，对具有双折射特性的物质进行显微观察的方法。

n       自然光和偏振光（光振动方向）

n       双折射和各向异性（寻常光和非寻常光）

n       偏振器件（天然，人工）

n       起偏、检偏和正交偏光

n       偏振光的干涉

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

w        微分干涉相衬显微术

n       原理

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

u       照明光束通过起偏器并投射到由两块石英棱镜胶合组成的诺曼尔斯基棱镜上，在胶合面上，光束分为寻常光和非常光平行地透过标本样品，这两束光经过物镜后再由诺曼尔斯基棱镜会聚，如果标本样品有细微的凹凸不平，会聚光束的波面就会产生水平侧向的位移，经检偏器后干涉可以得到鲜明的色彩和明暗立体感。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

u       观察活体细胞效果。

 

   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

           体细胞DIC照片                                             100x血液DIC照片